การโคลนยีน (GENE CLONING)
อ.ศักดนัย  สืบเสน
การโคลนยีน (GENE CLONING)
พันธุวิศวกรรม (Genetic  engineering)
พันธุวิศวกรรมเป็นเทคนิคของการปรับปรุงเปลี่นแปลงสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต  รวมถึงการยับยั้ง  การกระตุ้นการแสดงออกของยีน  และการใส่สารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตต่างชนิดเข้าไปในเซลล์  เทคนิคดังกล่าวอาจเรียกว่า  เทคโนโลยีรีคอมบิแนนต์ดีเอ็นเอ  (recombinant  DNA technology)  สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการถ่ายยีนเข้าไปเรียกว่า  transgenic organism  หรือ  genetically modified organism (GMO) พันธุวิศวกรรมมีขั้นตอนการดำเนินการ  ดังนี้
1.การเตรียมยีนหรือดีเอ็นเอที่ต้องการ
2.การโคลนยีนหรือดีเอ็นเอ
-        การนำยีนหรือดีเอ็นเอมาเชื่อมกับเวคเตอร์
-        การนำเวคเตอร์ลูกผสมเข้าสู่เซลล์ผู้รับ
-        การตรวจหาโคลนที่ต้องการ
-        การวิเคราะห์ยีนหรือดีเอ็นเอที่โคลนได้
3.การถ่ายยีนเข้าไปในสิ่งมีชีวิต
การโคลนยีนหรือดีเอ็นเอ
การโคลน (Cloning) หมายถึงการเพิ่มปริมาณผลผลิตให้เหมือนกับต้นแบบ การโคลนยีนหมายถึงการเพิ่มปริมาณยีนให้เหมือนกับยีนต้นแบบ  การโคลนเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตก็หมายถึงการเพิมปริมาณเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตต้นแบบหรือมียีโนไทป์ต้นแบบ ผลผลิตที่ได้จากการโคลนเรียกว่า โคลน(clone)
        การโคลนยีนหรือดีเอ็นเอมีขั้นตอนดังนี้คือ
1.  การเตรียมยีนหรือดีเอ็นเอที่ต้องการ     สามารถเตรียมได้จาก
1.ดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิต
การคัดเลือกท่อนยีนจากสายดีเอ็นเอบนโครโมโซม  สามารถทำให้สายดีเอ็นเอถูกตัดออกเป็นท่อน ๆ ได้โดยใช้  restriction  endonuclease  หรือโดยใช้แรงกระแทก
จาก  ultrasonication  แล้วจึงคัดดเลือกท่อนดีเอ็นเอที่มียีนที่เราต้องการ
2.        การสังเคราะห์
เป็นการสร้างยีนขึ้นมาโดยตรง  ยีนที่สังเคราะห์ขึ้นได้ครั้งแรกคือยีนของ
alanine  tRNA  สังเคราะห์โดยกลุ่มนักวิทยาศาสตร์ที่นำโดย  Dr. Khorana  ยีนของโปรตีนที่สังเคราะห์ได้เป็นครั้งแรกคือยีนของฮอโมน  somatostatin  ซึ่งมีกรดอะมิโนต่อกันเพียง  14  ตัวเท่านั้น     สังเคราะห์โดย  Dr. Itakura  แห่ง  City of Hope National medical Center , Duarte , California ,  ยีนของสาย polypeptide A และ B ของอินซูลิน ( มีกรดอะมิโน 20 และ 30 ตัวตามลำดับ )  ก็สามารถสร้างขึ้นได้  ยีนที่สังเคราะห์ขึ้นได้นี้เป็นยีนท่อนสั้น ๆ  ยีนของโปรตีนและเอ็นไซม์ทั่ว ๆ ไปมักมีความยาวหลายร้อยหรือเป็นพันเบสสังเคราะห์ได้ยากมากหรือกล่าวได้ว่าสังเคราะห์ไม่ได้
3.        การสร้างยีนโดยอาศัย  mRNA  เป็นแม่แบบ
การสร้างยีนโดยอาศัย  mRNA  เป็นแม่แบบนี้ทำได้โดยอาศัยหลัก  3  ประการ 
ประการแรกเนื่องจากยีนของคนเราแม้ว่าจะมีครบทุกยีนในทุกเซลล์ของร่างกาย  แต่เกิด  transcription  ของยีนนั้น ๆ ในเฉพาะเซลล์บางชนิดเท่านั้น  เช่นยีนของฮีโมโกลบินเกิด  transciption  ( คือมีการสร้าง  mRNA ของโกลบิน )  เฉพาะในเซลล์เม็ดเลือดแดงอ่อนเท่านั้น  ภายในเม็ดเลือดแดงอ่อนจึงมี  mRNA  ของโกลบินและ mRNA  ของโปรตีนอื่นที่จำเป็นสำหรับการดำรงชีวิตของเซลล์  แต่ส่วนใหญ่แล้วเป็น  mRNA  ของโกลบิน  ทำให้เรามีแหล่งของ mRNA  ชนิดที่จำเพาะ  อีกตัวอย่างหนึ่งคือ  mRNA  ของ  preproinsulin  มีในเบต้าเซลล์ของตับอ่อนเท่านั้น  เป็นต้น  สรุปได้ว่าแหล่งของ  mRNA  ที่จำเพาะก็คือเซลล์ที่ทำหน้าที่จำเพาะในการสร้างโปรตีนชนิดนั้น ๆ เมื่อทำให้เซลล์นั้นแตกก็จะมี  mRNA  กับส่วนประกอบอื่น ๆ ของเซลล์ปนกันอยู่  mRNA  ส่วนใหญ่มี  poly (A) อยู่ที่ปลาย 3'  ดังนั้นจึงสามารถแยก  mRNA  ออกจากส่วนอื่น ๆ ของเซลล์ได้โดยให้  poly (U)  sepharose  จับออกมาได้  mRNA  ที่ต้องการปนอยู่กับ  mRNA  ชนิดอื่น ๆ
        หลักการประการที่สอง  ที่ทำให้สร้างยีนโดยอาศัย mRNA  เป็นแม่แบบได้คือมีการค้นพบเอ็นไซม์  reverse  transciptase  หรือ  RNA-directed  DNA  polymerase ซึ่งทำหน้าที่สร้งดีเอ็นเอโดยอาศัย  mRNA  เป็นแม่แบบโดยตรง  เอนไซม์นี้สามารถสะกัดได้จากไวรัสชนิด  RNA virus  เช่น  avian  myeloblastosis  virus  ( AMV )
        และประการที่สามก็คือ  อาศัยความจำเพาะของการจับคู่เบสสายดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นจะมีการเรียงตัวของเบสสอดคล้องกันกับการเรียงตัวของเบสบนสาย  mRNA  สายดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นโดยวิธีนี้จึงได้ชื่อว่า  complementary  DNA  หรือ  cDNA
        ขั้นตอนของการสร้างยีนโดยอาศัย  mRNA  เป็นแม่แบบมีรายละเอียดดังนี้  ใส่  mRNA  ลงใน  medium  ที่เหมาะสม  มีฟอสเฟต  น้ำตาล deoxyribose  และเบสชนิดต่าง ๆ ครบครัน  พร้อมทั้งเติมเอ็นซัยม์  reverse  transciptase  จะเกิดการสร้างสาย  DNA สานเดี่ยวคือ  cDNA  ที่มีการเรียงตัวของเบสสอดคล้อง  ( complementary ) กับการจัดเรียงตัวของเบสบนสาย  mRNA  และปลาย 3'  ของ  cDNA  จะหักพับกลับเข้ามาเล็กน้อย  cDNA  นี้จะหลุดออกจาก  mRNA  เมื่อทำให้  medium  เป็นด่างแล้วจึงใส่เอ็นซัยม์  DNA  polymerase  มาต่อปลาย  3'  ของ  cDNA  ที่หักม้วนอยู่แล้วนั้นให้เป็น  double - strand  DNA  ที่ปลายข้างหนึ่งจับเป็นวงแล้วจึงตัดปลายข้างที่ยังจับกันเป็นวงนั้นด้วยเอ็นซัยม์  SI  nuclease  ( SI  endonuclease ) ได้ double-strand DNA
ซึ่งเป็นยีนที่ต้องการ  และมีท่อน  double - strand DNA  ซึ่งเป็นยีนอื่น ๆ อยู่ด้วยเพราะ
ว่า  mRNA  ที่ใช้เป็นแม่แบบนั้นไม่ได้เป็น  mRNA  ชนิดเดียวบริสุทธิ์  แต่ปริมาณส่วนใหญ่ก็จะเป็นยีนที่ต้องการเพราะเราเลือกเซลล์ที่เป็นแหล่งของ  mRNA  โดยที่ทราบว่าภายในเซลล์จะมี  mRNA  ชนิดใดเป็นส่วนใหญ่  แต่ปัจจุบันนี้มีวิธีแยก  mRNA  ชนิดใดชนิดหนึ่งให้บริสุทธิ์ได้จึงสามารถสร้าง  cDNA  ของยีนใดยีนหนึ่งที่บริสุทธิ์ได้
        ดีเอ็นเอจากแหล่งต่าง ๆดังกล่าวจะต้องนำมาตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะให้มีขนาดต่าง ๆ เพื่อเชื่อมเข้ากับเวคเตอร์เอนไซม์ตัดจำเพาะที่ใช้เป็เอ็นไซม์ที่สามารถจดจำลำดับเบสบนสายดีเอ็นเอที่ตัดอาจเป็นการจดจำ  4  หรือ  6  คู่เบส  ตัวอย่างเช่น  EcoRI, Smal  สามารถจดจำลำดับ  6  คู่เบส ส่วน Taql, Alul และ Haelll  สามารถจดจำลำดับ  4  คู่เบส  เป็นต้น  ตัวอย่างของเอ็นไซม์ที่จุลินทรีย์ผลิตและลำดับเบสที่จดจำได้แสดงไว้ที่ตาราง
ตารางที่ 1   เอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดต่าง ๆ
   เอ็นไซม์                 จุลินทรีย์ที่ผลิต                ลำดับเบสและตำแหน่งที่ตัด
   Alul                          Arthrobacter                          5'- -A-G-C-T- -3'
                                                        3'- -T-C-G-A- -5'
   BamHl        bacillus amyloliquefaciens H                   5'- -G-G-A-T-C-C- -3'
                                                        3'- -C-C-T-A-G-G- -5'                       
   EcoRI                 Escherichia  coli                            5'- -G-A-A-T-T-C- -3'                                                                    3'- -C-T-T-A-A-G- -5'
   EcoRll               Escherichia  coli                            5'- -C-C-T-G-G- -3'
                                                            3'- -G-G-A-C-C- -5'
   Haelll         Haemophilus  aeryptius                        5'- -G-G-C-C- -3'
                                                        3'- -C-C-G-G- -5'
   Hindlll        Haemophilus  influenzae  b                5'- -A-A-G-C-T-T- -3'                                                                3'- -T-T-C-G-A-A- -5'
           Pst l                        Providencia  sturtii                5'- -C-T-G-C-A-G- -3'                                                                3'- -G-A-C-G-T-C- -5'
   Sal l                       Streptomyces  albus                5'- -G-T-C-G-A-C- -3'                                                                3'- -C-A-G-C-T-G- -5'
  2.   การนำยีนหรือดีเอ็นเอมาเชื่อมกับ Vector
        เมื่อได้ดีเอ็นเอหรือยีนที่ต้องการมาแล้ว  การที่จะให้ดีเอ็นเอนั้นไปรวมตัวกับดีเอ็นเอของ host  cell  จำเป็นต้องอาศัย vector ซึ่งได้แก่
1.        Plasmid ซึ่งเป็น Extra chromosomal DNA ของ Bacteria มีลักษณะเป็นวงแหวนมีขนาด < 10 Kb
2.        Bacteriophage  มีขนาด  20  Kb
3.        Cosmid  เป็น  Bacteriophage  รวมกับ  plasmid  ขนาด  40  Kb
การนำยีนหรือดีเอ็นเอมาเชื่อมกับเวคเตอร์  เช่น พลาสมิด  โดนการตัดพลาสมิด
ด้วยเอ็นไซม์จำเพาะชนิดเดียวกันกับที่ตัดดีเอ็นเอแล้วใช้เอ็นไซม์ไลเกส  ( ligase  )
เชื่อมดีเอ็นเอให้เข้ากับเวคเตอร์  ได้เป็นเวคเตอร์ลูกผสม (รูปที่ 2)
3.   การนำ  Recombinant  vector  เข้าสู่  host  cells
        การนำเวคเตอร์ลูกผสมเข้าสู่เซลล์ผู้รับ  เช่น  E.  coli  โดยทำให้เซลล์ผู้รับอยู่ในสภาพที่พร้อมหรือเหมาะสม  เรียกว่า  เซลล์คอมพีเทนต์  (  competent  cell  )  ซึ่งสามารถกระทำได้ด้วยการใช้สารเคมี  เช่น  CaCl2 ,  MgCl2  ,  CoCl2  ,  KCl  ,  dimethysulfoxide  ที่อุณหภูมิ  0 - 42  องศาเซลเซียส  หรือใช้ไฟฟ้าเพื่อให้เกิดรูหรือช่องที่เยื่อหุ้มเซลล์  หลังจากนั้นก็นำเวคเตอร์ลูกผสมเข้าไปในเซลล์ผู้รับ  เรียกกระบวนการนี้ว่า  การทรานสฟอร์ม  ( transformation )  และเรียกเซลล์ผู้ที่มีเวคเตอร์ลูกผสมนี้ว่า  ทรานสฟอร์แมนต์  ( transformant )  เมื่อทรานสฟอร์แมนต์มีการแบ่งเซลล์เพิ่มจำนวนก็เท่ากับว่ายีนหรือดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปนั้นเพิ่มจำนวนขึ้นด้วย
4.   การตรวจหาโคลนที่ต้องการ  ( Identification  of  cells  that  recombination DNA  Molecules
เนื่องจากดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปในเวคเตอร์มาจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อเป็นดีเอ็นเอทั้งหมดในสิ่งมีชีวิตนั้น  ( genomic  DNA )  เมื่อตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะจะมีจำนวนมากมาย  หรือเป็นดีเอ็นเอที่สังเคราะห์มาจากอาร์เอ็นเอซึ่งก็มีมากมายหลายชนิดเช่นเดียวกัน  เมื่อถ่ายเข้าสู่เซลล์ผู้รับแล้วจึงมีเซลล์จำนวนมากและแต่ละเซลล์ได้รับชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน  เรียกว่าเป็นห้องสมุดดีเอ็นเอ  ( DNA  library )  จึงมีความจำเป็นต้องเลือกโคลนที่มีชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนที่ต้องการด้วยวิธีตรวจสอบ  Phenotype ,  คัดเลือกด้วย  Immuno  chemical  โดยใช้  antibody  หรือเลือกโดยการทำ  colony  hybridization
การทำ  Colony  hybridization
การวิเคราะห์ยีนหรือดีเอ็นเอที่โคลนได้  จากผลของโคโลนีไฮบริไดเซชัน  ก็สกัดพลาสมิดจากโคโลนีที่ต้องการหลังจากนั้นนำมาตรวจสอบขนาดด้วยเทคนิคอิเล็กโตรโฟริซิส  เปรียบเทียบขนาดของพลาสมิดและพลาสมิดที่มีชิ้นของดีเอ็นเออยู่  (พลาสมิดลูกผสม )  การโคลนยีนในแบคทีเรียนี้นนอกจากจะเพิ่มปริมาณยีนที่โคลนได้แล้วยังสามารถทำให้แบคทีเรยสร้างโปรตีน  ฮอร์โมน  อินเทอเฟียรอนหรือเอนไซม์ต่าง ๆ ได้อีกด้วย (รูปที่ 5)
การโคลนยีนในแบคทีเรียและผลผลิตที่ได้  ( Alcamo , 1996 )
การถ่ายยีนเข้าไปในสิ่งมีชีวิต
        หลังจากการโคลนยีนหรือแยกยีนที่ต้องการจากเซลล์ของสิ่งมีชีวิตชนิดหนึ่งได้แล้ว  จึงนำมาามช้ประโยชน์หรือทดสอบการทำงานต่อไปโดยถ่ายยีนหรือดีเอ็นเอนั้นเข้าไปในสิ่งมีชีวิตที่ต้องการ  ในขั้นตอนนี้ต้องเติมโปรโมเตอร์  ( promoter )  ซึ่งเป็นส่วนของยีนในยูคาริโอต  โปรคาริโอตหรือไวรัสเข้าไปยังชิ้นดีเอ็นเอที่โคลนได้  เดื่อให้ยีนแสดงออกหรือสามารถทำงานได้ในสิ่งมีชีวิตนั้น
รูปที่ 5 การโคลนยีนแบคทีเรียและผลผลิดที่ได้ (Alcamo,1996)
การถ่ายยีนในสัตว